Una tesi di laurea per sconfiggere l'atassia

Nei laboratori di Ferrara, dove sta entrando nel vivo il progetto di Ricerca finanziato dalla nostra Fondazione,

ha lavorato Giacomo Gastaldello, tirocinante, che in questi mesi, affiancando la ricercatrice Francesca Salvatori e sotto la costrante guida della Professoressa Marconi, ha potuto terminare la stesura della Tesi di Laurea in Biotecnologie per la Salute dal titolo: "CRISPR/Cas: nuova strategia per la cura dell'atassia spinocerebellare di tipo I"

Oggi, giorno della discussione della tesi, abbiamo chiesto a Giacomo qualcosa in più della sua esperienza.

• Cosa ti ha portato a fare ricerca e una tesi sull'atassia?

"Per il mio tirocinio finalizzato alla stesura della tesi ho chiesto sin dal primo momento la disponibilità della Professoressa Marconi, che mi ha parlato della possibilità di lavorare a questo progetto e di poterne seguire la fase iniziale. Data l'importanza del tema in questione e l'opportunità di crescita personale e professionale ho fortemente desiderato partecipare all'attività di ricerca e, fortunatamente, così è stato."

• Su cosa hai lavorato in questi mesi nei laboratori dell'Università di Ferrara?

"Durante i mesi trascorsi in laboratorio ho potuto seguire la nascita di questo interessante progetto di ricerca. Abbiamo sviluppato la strategia terapeutica descritta nella mia tesi di laurea, che prevede il silenziamento dei geni mutati e la veicolazione di quello esprimente la proteina wild type; in particolare ho lavorato su linee cellulari immortalizzate, sulle quali è stato silenziato il gene dell'atassina mediante l'innovativo sistema CRISPR/Cas."

• Quanto è importante per te la ricerca per le malattie degenerative?

"La ricerca in questo ambito è sicuramente di fondamentale importanza, dal momento che attualmente non ci sono terapie per molte di queste patologie. La ricerca è infatti il primo step per arrivare a una soluzione che possa migliorare la vita delle persone affette da questi disturbi, una via che dev'essere necessariamente percorsa per giungere a tal fine."

Nella Foto da sinistra: Francesca Salvatori, Giacomo Gastaldello, Matteo Sivieri, Giampietro Domenicali

Segue Abstract della Tesi

L’atassia spinocerebellare di tipo 1 (Sca) è una malattia autosomica dominante causata dall’espansione di un tratto poliglutammico presente nell’esone 8 del gene dell’atassina (atxn1). Tale mutazione porta alla produzione di una proteina ATXN1 modificata, che, interagendo in modo alterato con i suoi partner, risulta essere neurotossica, causando la degenerazione inizialmente delle cellule del Purkinje e, con l’incedere della patologia, di quelle del midollo spinale e del tronco encefalico.

Poiché allo stato attuale della ricerca non è ancora stata sviluppata una terapia definitiva né tantomeno di attenuazione dei sintomi per questa malattia altamente invalidante e con esito fatale, in collaborazione con la fondazione ACAREF di Ferrara, abbiamo deciso di sviluppare una strategia terapeutica innovativa con lo scopo di bloccare l’insorgenza e/o la progressione della patologia. Tale strategia prevede da un lato il knockout dei geni atxn1 endogeni, poiché non è ancora possibile attuare un silenziamento specifico per quello mutato, e dall’altro l’inserimento di un gene esogeno wild type, in grado di ricostituire la quantità di proteina necessaria per la sopravvivenza della cellula. Per l’editing genomico, abbiamo deciso di utilizzare l’innovativa tecnologia offerta dalla piattaforma CRISPR/Cas9, un’evoluzione di quello che si è scoperto essere un sistema d’immunità acquisita dei procarioti, che attualmente sta rivoluzionando il modo di apportare modifiche al DNA in linee cellulari e organismi.

La validazione di questo approccio terapeutico prevede successivi step, partendo dal silenziamento dei geni atxn1 endogeni e l’inserimento del gene esogeno in cellule immortalizzate, per passare a modelli cellulari più complessi che mimino la situazione patologica fino ad arrivare a modelli murini di Sca1.

La mia tesi ha previsto lo sviluppo della prima parte del progetto e cioè il silenziamento dei geni atxn1 endogeni in cellule immortalizzate. In seguito alla caratterizzazione a livello di RNA e proteine delle cellule U266, HeLa, HepG2 e K562, abbiamo scelto di veicolare i vettori esprimenti la Cas9 e due diversi gRNA (chiamati G1 e G2) nelle cellule U266 e HeLa, in quanto esprimono alti livelli, rispettivamente, di trascritto e proteina ATXN1. Abbiamo quindi proceduto alla caratterizzazione delle cellule trasfettate in modo da verificare da un lato l’efficienza di trasfezione e dall’altro la capacità dei due vettori di indurre il silenziamento del gene atxn1. In particolare, i risultati finora ottenuti evidenziano una maggior efficienza di trasfezione e inserzione per il vettore pCas-Guide G2, mentre, dall’analisi dei dati di Real Time qRT-PCR, il pCas-Guide G1 correla con una diminuzione più marcata dei livelli di trascritto del gene atxn1. Nelle prossime settimane si procederà con la verifica a livello genomico della presenza di mutazioni indotte dal taglio mediato da Cas9 e a livello proteico dei livelli di inibizione della produzione della proteina ATXN1, completando così l’insieme dei dati ricavati finora. Inoltre, a breve potrà essere isolato un clone omozigote per il knockout, in modo da poter procedere con la veicolazione del gene atxn1 corretto per verificare il ripristino della produzione della proteina wild type.